臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試病理學(xué)知識點精講

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第十九節(jié) 免疫性檢測技術(shù)

大綱要求：

1.抗體的檢測及應(yīng)用(1)概念(2)沉淀反應(yīng)(3)凝集反應(yīng)和血型的鑒定(4)免疫熒光(5)放射免疫(6)酶免疫(elisa和免疫組化)(7)化學(xué)發(fā)光(8)免疫電鏡(9)免疫沉淀(10)免疫印跡(11)親和層析

2.免疫細胞的分離(1)ficoll-hypaque離心法(2)磁珠分離法(3)流式細胞術(shù)

3.免疫細胞的特異性、數(shù)量和功能檢測(1)流式細胞術(shù)(2)酶免疫斑點試驗(3)細胞因子的細胞內(nèi)染色(4)四聚體法(5)增殖試驗(6)細胞毒試驗(7)細胞凋亡檢測(8)芯片技術(shù)(9)細胞因子的生物活性檢測

講義內(nèi)容：

一 抗體的檢測及應(yīng)用抗體進行的檢測

1. 概念：免疫學(xué)檢測的基本原理是抗原-抗體的特異性結(jié)合，其特點為：高特異性、可逆性、抗原抗體濃度和比例決定出現(xiàn)免疫復(fù)合物的性狀不同。

2. 根據(jù)抗原物理性狀差異或參與的輔助成分的不同，可出現(xiàn)不同的反應(yīng)，包括：

(1) 凝集反應(yīng)

(2) 沉淀反應(yīng)

(3) 中和反應(yīng)

常稱為血清反應(yīng)。

3. 沉淀反應(yīng)：毒素等可溶性抗原和相應(yīng)特異性抗體以合適比例結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)，一般在液體中和半固體瓊脂凝膠中反應(yīng)。

(1) 免疫比濁法：一定量抗體中分別加入相應(yīng)遞增量的可溶性抗原，抗原抗體結(jié)合形成數(shù)量不等的ic，使反應(yīng)體系呈現(xiàn)不同的濁度。當抗體含量固定且過剩時，免疫復(fù)合物的多少(濁度)可提示抗原濃度，通過自動化濁度儀，可同時檢測樣品中多種分子并進行精確定量分析。快速、簡便，常用于檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿微量蛋白及各種免疫球蛋白和補體

(2) 單向免疫擴散：將已知一定濃度的抗體均勻混合于42-50℃已經(jīng)熔化的瓊脂中，制成凝膠板。隔適當距離打孔，加入被檢測可溶性抗原，使其向四周擴散;抗原與瓊脂中的抗體相遇，一定時間后，在比例適宜處形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)，由于沉淀環(huán)的直徑與抗原濃度相關(guān)，可查標準曲線，找出抗原含量，可用于血清中免疫球蛋白g、c3、afp和其他可溶性抗原定量檢查。

(3) 雙向免疫擴散：在瓊脂班上相鄰的兩孔中分別加入抗原和抗體，使其在瓊脂中擴散，兩者比例適當時，可在兩孔間的適當位置形成白色沉淀線，常用于檢測：抗原或抗體的定性;對復(fù)雜的抗原或抗體成分進行純度鑒定;血清免疫球蛋白的效價測定(半定量)。

(4) 免疫電泳：先將待測抗原樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，使不同的組分依據(jù)電泳速度不同分散，而后在樣品泳道一側(cè)的適當距離處挖一和泳道平行的直線溝槽，在槽內(nèi)加入已知抗體，讓抗體和抗原進行雙向免疫擴散，在泳道和槽的中間形成沉淀線，可用于血清蛋白的組分分析，如免疫球蛋白增多疾病的診斷;對流免疫電泳：抗原、抗體同時電泳，中間形成沉淀線。

4. 凝集反應(yīng)和血型鑒定：顆粒性抗原(細菌、紅細胞、偶聯(lián)抗原的乳膠顆粒)與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集抗原

(1) 直接凝集：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生的凝集反應(yīng) 。可鑒定細菌和血型如玻片法為定性試驗，常用于菌種鑒定或人類abo血型的鑒定。試管法常用于抗體效價的檢測。

(2) 間接凝集：將可溶性抗原或抗體包被在紅細胞或乳膠顆粒載體表面后，與相應(yīng)抗體或抗原作用出現(xiàn)的凝集。顆粒載體有紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒，相應(yīng)間接凝集現(xiàn)象稱為間接血球凝集、間接乳膠凝集，如類風(fēng)濕因子的檢測(人igg吸附在乳膠顆粒)，將已知抗體吸附在載體上的凝集稱為反向間接凝集，如rh血型不符檢測中對患者抗紅細胞rh抗原igg的檢測。

(3) 提高靈敏性的辦法:已知抗體或抗原標記上酶、熒光素、放射性核素、膠體金等，可進行定量檢測，并可檢測在組織細胞中的定位和分布。

5. 免疫熒光：用熒光標記的抗體或(抗原)分子檢測相對應(yīng)的抗原或抗體分子的技術(shù)。常用的熒光素包括fitc、藻紅蛋白(pe)在激發(fā)光作用下可分別發(fā)綠色或紅色熒光，在病原體的診斷、細胞表面cd標志的鑒定等方面用途廣泛

(1) 直接熒光法 把熒光素直接標記的抗體與待檢細胞或組織切片相互作用，測定未知抗原，用熒光顯微鏡、流式細胞儀或con-focal進行觀察及鑒定

(2) 間接熒光法 將特異性抗體與待測抗原相互作用后，加入熒光素標記的抗一抗抗體，既可檢測抗原又可檢測抗體。

6. 放射免疫：用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定，同位素的高度敏感性使該方法具有重復(fù)性好、準確度高的優(yōu)點，廣泛用于激素等微量物質(zhì)和ctl功能的檢測，敏感性可高達pg/ml的水平,常用的有125i等

7. 酶免疫(elisa和免疫組化)：酶標記一抗或二抗檢測特異性抗原或抗體的方法;將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來，通過酶分解底物產(chǎn)生有色物質(zhì)(或熒光)，用酶標儀測定光密度值，反應(yīng)抗原或抗體的含量，常用hrp、alp。

(1) elisa：將抗原或抗體與固相載體(聚苯乙烯)結(jié)合，加入待測抗體或抗原，最后以酶標二抗和底物進行檢測的技術(shù)。簡單、快速、特異性強，用于檢測抗原和血清抗體效價，最常用

雙抗夾心法：檢測液相中的可溶性抗原，包被抗體，洗去未吸附抗體，加入待測抗原，37℃1h,抗原與固相抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合抗原，加入酶標二抗，加入底物顯色，檢測od值地阿姨奧抗原抗體的量和效價

間接elisa：已知抗原包被，加入待檢抗體，然后加酶標二抗，洗滌后加底物檢測

(2) 免疫組化：應(yīng)用標記的特異性抗體在組織細胞原位(冰凍或石蠟切片)通過抗原抗體反應(yīng)和酶-底物的顯色反應(yīng)，用于定位、定性、定量檢測組織或細胞中的抗原，具有免疫反應(yīng)的特異性和組織化學(xué)的可見性。

8. 化學(xué)發(fā)光：用發(fā)光物質(zhì)標記的抗原或抗體檢測抗體或抗原的方法，結(jié)果用發(fā)光光度計檢測。具有發(fā)光分析高靈敏性，分離簡單，自動化分析，發(fā)光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析

9. 免疫電鏡：免疫技術(shù)與電鏡技術(shù)相結(jié)合，在超微結(jié)構(gòu)水平觀察抗原、抗體結(jié)合定位的方法。利用帶有特殊標記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，形成一定電子致密度的復(fù)合物，電鏡下觀察定位。

10. 免疫沉淀：研究蛋白相互作用的經(jīng)典方法

12. 免疫印跡：(western blotting)

13. 親和層析：利用分子間專一的親和力來分離或純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，將親和對中的一個固定在基質(zhì)上，制成分離柱，利用分子間親和的特異性和可逆性，進行分離純化。

二 免疫細胞分離

常用于包括人外周血單個核細胞(pb-mc)、脾臟淋巴細胞和淋巴結(jié)淋巴細胞分離，pb-mc最常用，t、b分離第一步。

1. ficoll-hypaque離心法：

(1) 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法是分離制備pbmc最常用方法;根據(jù)外周血中各種血細胞比重不同使不同密度細胞呈梯度分布。

(2) 抗凝血疊加于分離液上，低速離心，細胞分層

rbc：管底;pbmc：血漿層與分離液界面;最上層：血漿，plt懸浮其中;利用單核細胞粘附塑料的特性，可從pbmc中除去

2. 磁珠分離法：利用免疫磁珠(特異性抗體與磁性微粒的交聯(lián)物)進行特異性淋巴細胞分離的方法;將cd4/cd8等特異性抗體吸附在磁性微珠上，加到細胞懸液中，與具有相應(yīng)抗原的細胞結(jié)合，在置于磁場中，攜帶有相應(yīng)細胞的免疫磁珠吸附于靠近磁鐵的管壁，即可分離，得到細胞。

3. 流式細胞術(shù)：利用熒光活化細胞分析儀(facs)通過細胞表面cd分子的檢測而對細胞進行分類和定量的方法;熒光素標記的mab與細胞表面特異cd分子結(jié)合，而后將細胞液滴射流經(jīng)流動室噴嘴以單個細胞噴出，并經(jīng)高速聚焦激光照射，以激發(fā)熒光顏色和強度標識是否具有相應(yīng)cd分子，可鑒定、分離不同細胞，可單色、雙色、多色，進行周期、凋亡分析。

三 免疫細胞的特異性、數(shù)量和功能檢測

1. 流式細胞術(shù)(fcm)：根據(jù)表面表達cd分子的種類、水平和多種cd表達格局，以流式細胞術(shù)可以二維熒光方圖和比例統(tǒng)計顯示待測細胞群體中某群cd+細胞的比例及數(shù)量、cd分子表達的水平高低，同時以ifnγ等因子或annexinv 凋亡標志,可以測定的功能性ctl、凋亡細胞的比例，以fitc標記靶細胞，通過熒光強度的減弱程度可測定ctl的殺傷活性。

2. 酶免疫斑點試驗(elisapot)：功能性細胞(分泌細胞因子)的定量檢測;用細胞因子的抗體包被硝酸纖維膜(nc)或聚二氟乙烯(pvdf)覆蓋96孔板，加入待檢細胞，經(jīng)抗原特異性刺激后，功能性細胞分泌細胞因子，可被包被的抗體捕獲。加抗細胞因子的二抗、生物素-親和素放大系統(tǒng)、酶及底物顯色后，板底分泌相應(yīng)細胞因子的細胞所在局部產(chǎn)生有色斑點,一個斑點代表一個分泌相應(yīng)細胞因子的細胞,根據(jù)斑點數(shù)量判斷功能性細胞的數(shù)量;根據(jù)斑點深淺,判斷細胞因子的相對含量。

3. 細胞因子的細胞內(nèi)染色：功能性細胞的facs定量分析;首先特異性抗原刺激t細胞分泌細胞因子，而后用fitc-cd4染色，同時阻斷細胞因子分泌，加入穿膜劑，再加入抗細胞因子單抗(pe標記)，最后facs檢測同時激發(fā)紅、綠色細胞亞群，及分泌相應(yīng)細胞因子的cd4+t細胞。

4. 抗原肽-mhc分子四聚體法：定量分析抗原特異性ctl的facs新技術(shù);特異性抗原肽、可溶性mhci類分子重鏈及β2微球蛋白在體外正確折疊，借助生物素-親和素原理，構(gòu)建1個熒光素標記的親和素

（責(zé)任編輯：中大編輯）

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